Assurer la reproductibilité en recherche grâce à des modèles de cellules souches pluripotentes humaines

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Juin 2024

Une contribution de STEMCELL Technologies

Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines constituent un outil tout à fait révolutionnaire qui peut être utilisé pour un large éventail d’applications en recherche biomédicale, par exemple pour la modélisation des maladies, la découverte des médicaments et la médecine régénératrice. Pour qu’une recherche à base de CSPi humaines soit reproductible, il faut disposer de lignées et de banques de CSPi ayant fait l’objet d’une caractérisation et d’un contrôle de la qualité exhaustifs. Heureusement, le milieu de la recherche et diverses organisations se sont associés pour créer des outils et établir des pratiques exemplaires permettant d’assurer la reproductibilité scientifique et de maximiser le potentiel des CSPi. Le texte qui suit permet de comprendre certains des défis les plus courants auxquels sont confrontés les utilisateurs de CSPi, l’importance de normaliser la déclaration des données sur les CSPi et les mesures de contrôle de la qualité, ainsi que les moyens qui sont à la disposition des chercheurs pour surmonter les obstacles qui se posent à eux et augmenter leurs chances d’atteindre leurs objectifs de recherche.

Normalisation de la déclaration des données sur les CSPi et des mesures de contrôle de la qualité

De nombreuses lignées de CSPi sont offertes sur le marché, mais elles ne répondent pas toutes aux normes de qualité requises. En 2018, une analyse de plus de 3 500 articles de recherche sur les CSPi a déterminé que plus de 10 000 lignées de CSPi étaient citées dans la littérature scientifique¹. Ce chiffre et la constatation qu’approximativement un tiers des lignées déposées à la banque de cellules souches WiCell aux fins de distribution ne répondaient pas aux critères de qualité minimale² soulèvent des inquiétudes quant à l’absence de consensus sur les attributs de qualité des CSPi et la reproductibilité des recherches réalisées par les différents groupes de recherche. Pour obtenir des résultats reproductibles et fiables avec les CSPi, il faut absolument établir des critères normalisés de caractérisation, de contrôle de la qualité et de maintenance des cellules souches.

Sans normalisation, il est difficile d’interpréter les observations scientifiques fondamentales, d’extrapoler les conclusions pertinentes sur le plan clinique, d’assurer la reproductibilité des expériences et de comparer les résultats des différentes études. Considérant ces facteurs, l’International Society for Stem Cell Research (ISSCR) a publié les Normes relatives à l’utilisation de cellules souches humaines dans la recherche, un document qui fournit une série de recommandations établissant des critères minimaux de caractérisation et de déclaration des données pour les chercheurs qui utilisent des cellules souches humaines.

Pour planifier et mener vos recherches sur les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) conformément aux Normes relatives à l’utilisation des cellules souches humaines dans la recherche de l’ISSCR, il est essentiel de comprendre les facteurs suivants :

1. Processus techniques

Cultiver des CSPi de haute qualité est exigeant sur le plan technique et nécessite un personnel qualifié pour surveiller en permanence la morphologie des cellules, nourrir les cellules et repiquer ensuite les cellules afin de maintenir la qualité de la culture. Les cellules doivent rester indifférenciées et toute zone de différenciation spontanée doit être rapidement éliminée. Des mesures détaillées de caractérisation doivent être effectuées en continu, y compris après la création des banques cellulaires maîtresses et des banques cellulaires de travail. Ces processus exigeants en main-d’œuvre impliquent la production d’un grand nombre de fioles de CSPi cryoconservées et, par la suite, la mise en œuvre de procédures approfondies de caractérisation pour garantir l’homogénéité entre les lots et au sein d’un même lot. Toute variation doit être identifiée et corrigée afin d’assurer la reproductibilité des expériences.

2. Contamination

Dans le cadre d’une étude réalisée en 2019 par WiCell², plus d’un tiers des lignées de CSPi présumées être de bonne qualité ont échoué aux tests de base, et 4 % d’entre elles se sont révélées non stériles. Par ailleurs, des sondages menés auprès de laboratoires de culture cellulaire et de banques cellulaires ont révélé qu’en moyenne, 15 à 35 % de toutes les cultures cellulaires seraient contaminées par des mycoplasmes³,⁴. Cette contamination a des effets néfastes sur les cultures de CSPi, entraînant une augmentation des taux d’apoptose, des changements dans la morphologie des cellules et une diminution de leur viabilité et taux de prolifération. De plus, une contamination microbienne entraîne des changements dans l’expression des gènes, tels que la régulation à la baisse des marqueurs de cellules indifférenciées et la régulation à la hausse des gènes qui interviennent dans les mécanismes de réponse au stress et d’activation immunitaire. Par conséquent, des mesures de contrôle microbiologique et des techniques d’aseptisation rigoureuses doivent être mises en œuvre pour réduire au minimum le risque de contamination des cultures de CSPi.

3. Stabilité génétique

Une culture de CSPi humaines peut subir des modifications génétiques et épigénétiques récurrentes lors d’un événement de sélection potentielle, tel que le transfert d’un contenant à un autre des cellules à des fins de repiquage ou de clonage. Ces modifications récurrentes impliquent souvent l’ajout des chromosomes 12, 17, 20 et X, à savoir de variants similaires à ceux que l’on trouve dans les cancers humains. Ces anomalies caryotypiques peuvent affecter le comportement des cellules et compromettre l’utilité des CSPi pour la modélisation des maladies, le criblage des médicaments et les applications de thérapies cellulaires. Les aberrations peuvent aussi inclure de grandes anomalies chromosomiques, des variants souschromosomiques, des variations du nombre de copies (CNV) ainsi que des mutations ponctuelles de nucléotides. Malheureusement, une méthode différente de détection doit être utilisée pour identifier chaque type d’anomalie. De plus, on a constaté que les mutations des gènes suppresseurs de tumeurs TP53⁵ et BCOR⁶ s’accumulent au fur et à mesure du vieillissement des CSPi, ce qui a pour effet de limiter leur utilité clinique. Une analyse génétique régulière des cultures de CSPi de longue durée et une solide stratégie de gestion des banques cellulaires sont essentielles pour identifier toutes les mutations qui peuvent survenir et apporter les correctifs nécessaires.

4. Variabilité et normalisation

La reproductibilité est un aspect essentiel de tout programme de recherche scientifique, mais la grande variabilité entre les lignées de CSPi humaines rend difficiles l’obtention systématique de résultats analogues et la comparaison des données issues d’études différentes. La variabilité d’une lignée à l’autre de CSPi résulte des différences génétiques et épigénétiques qui existent entre les individus et de la variabilité des processus de reprogrammation et des conditions de culture. La variabilité entre les résultats de chaque repiquage peut découler des variations entre les diverses techniques de repiquage et conditions de culture utilisées et du processus de la dérive génétique. Les différences entre les protocoles expérimentaux (non normalisés) et le manque de clarté dans la déclaration des détails expérimentaux contribuent de plus à accroître la variabilité des résultats. Pour résoudre ces problèmes, plusieurs initiatives ont été lancées, notamment l’Initiative sur les normes de l’ISSCR et hPSCreg®, qui ont respectivement pour but de fournir des lignes directrices cohérentes sur la déclaration des résultats et une banque centralisée de lignées cellulaires enregistrées, traçables et validées.

5. Coûts

La recherche sur les CSPi humains peut être une entreprise coûteuse. Cultiver à long terme des CSPi exige que les expériences et la maintenance des cellules soient effectuées par du personnel spécialisé et hautement qualifié. Les expériences doivent être reproduites et l’optimisation des procédures expérimentales, par exemple les protocoles de différenciation, peut rapidement augmenter les coûts de main-d’œuvre. La culture des CSPi nécessite des conditions spécialisées, notamment l’utilisation de milieux définis associés à des facteurs de croissance strictement homologués. Même les plus petites variations dans la qualité des réactifs peuvent affecter la viabilité et la fonctionnalité des cellules, c’est pourquoi les systèmes de culture fabriqués commercialement et homologués peuvent être très utiles. La variabilité potentielle de la qualité des lignées cellulaires impose la mise en œuvre de contrôles rigoureux de la qualité, qui peuvent accroître considérablement les coûts de recherche, surtout s’ils sont effectués fréquemment. Parmi les autres facteurs, on doit aussi compter le coût des équipements et les coûts de conformité réglementaire, par exemple pour l’obtention des approbations en matière d’éthique pour les dons de tissus de patients à des fins de reprogrammation. Apprenez-en davantage sur la qualité des cellules ici.

Des outils hautement caractérisés pour normaliser et accélérer vos recherches à base de CSPi

La reproductibilité des recherches à base de CSPi peut être simplifiée par l’utilisation de lignées cellulaires ayant fait l’objet d’une caractérisation exhaustive et d’un contrôle de la qualité rigoureux. Que vous souhaitiez conserver à long terme des CSPi de haute qualité ou en avoir à votre disposition pour alimenter rapidement vos applications en aval, STEMCELL Technologies peut vous aider. Amorcez votre recherche avec des sources de CSPi de haute qualité, y compris notre nouvelle lignée de CSPi destinée à la recherche fondamentale et à des usages commerciaux, SCTi003-A, obtenue à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) d’une donneuse en bonne santé. Pour des CSPi sans maintenance, choisissez notre lignée novatrice iPSCdirect🅪 à usage unique, dérivée de sa lignée mère SCTi003-A.

SCTi003-A : Une lignée contrôle de CSPi de haute qualité, caractérisée de manière exhaustive

Si vous cherchez à vous procurer sur le marché une lignée de CSPi pour une culture à long terme ou pour une expansion à plus grande échelle, SCTi003-A est une lignée contrôle saine qui peut être ainsi utilisée, par exemple dans le cadre d’études de comparaison avec des lignées de cellules malades, pour valider des processus et/ou des protocoles, pour l’édition de gènes, et plus encore. Nos évaluations de la qualité et nos critères de libération sont fondés sur les recommandations et les orientations ayant émané de l’International Stem Cell Banking Initiative⁷, de la Global Alliance for iPSC Therapy⁸ et de l’atelier de consensus organisé en juin 2022 par l’Initiative sur les normes de l’ISSCR.

Répondez aux exigences réglementaires applicables aux travaux universitaires ou commerciaux en utilisant des CSPi d’origine éthique recueillies conformément aux protocoles acceptés par les comités d’examen d’établissements (CEE). Ces cellules ont été recueillies aux États-Unis, en conformité avec les lois, la réglementation et les directives fédérales, étatiques et locales applicables. De plus, les membres de notre groupe de donneurs sains ont été présélectionnés à l’aide d’un questionnaire visant à exclure toute personne atteinte d’une maladie, d’un trouble sanguin ou de tout autre problème de santé. La lignée SCTi003-A a été homologuée par le registre mondial hPSCreg® de lignées de CSP, créé pour offrir aux chercheurs un catalogue centralisé et consultable et une source de données fiables qui vérifie la conformité éthique et biologique des lignées en se fondant sur les normes établies par le milieu de la recherche. Le certificat d’homologation de lignée cellulaire hPSCreg® est exigé par certains organismes de financement (p. ex. pour l’utilisation d’une lignée de CSPh dans le cadre d’une recherche financée par l’Union européenne). Rendez-vous sur la site Web de hPSCreg® pour en savoir plus sur la lignée SCTiOO3.

Tableau 1. La lignée de CSPi SCTi003-A a été générée à partir de cellules d’une donneuse saine

Note 1 : Seules les fioles de CSPi provenant de la banque cellulaire commerciale sont offertes sur le marché.

Note 2 : Les CSPi de la banque cellulaire commerciale ont été caractérisées pour tous les critères d’évaluation à différents stades du processus de fabrication.

Les caractéristiques démographiques, de santé et génétiques de la donneuse SCTi003-A ont été compilées en fonction des renseignements qu’elle a déclarés et des données de séquençage de l’exome entier. Le sexe a été déterminé d’après le caryotype. L’ascendance a été calculée par analyse EthSEQ à partir des données de séquençage de l’exome entier. L’haplotype HLA a été déterminé au moyen d’un procédé de séquençage de nouvelle génération, du typage par séquençage et de sondes oligonucléotidiques correspondant à la séquence, selon les besoins, afin d’obtenir la résolution requise. D’autres variants génétiques ont été déterminés par séquençage de l’exome entier en utilisant la méthode d’analyse ClinVar. Le groupe sanguin (ABO/Rh) a été déterminé au moyen d’un procédé de séquençage de nouvelle génération. La taille, le poids et l’I🅪 ont été calculés au centre de dons.

La lignée SCTi003-A a été optimisée pour la rendre compatible avec la famille de milieux de culture sans cellules nourricières TeSR🅪, pour la maintenance, et avec STEMdiff🅪 pour une maintenance normalisée de haute qualité et une différenciation robuste. Jusqu’à maintenant, la compatibilité de SCTi003-A a été testée avec plus de 20 protocoles de différenciation STEMdiff🅪 prêts à l’emploi, notamment la différenciation en cellules progénitrices neurales (figure 1), cellules de la microglie, neurones du cerveau antérieur, neurones du cerveau moyen, astrocytes, organoïdes cérébraux, cardiomyocytes atriaux et ventriculaires, cellules progénitrices hématopoïétiques, cellules endothéliales, organoïdes intestinaux, et bien d’autres encore.

Figure 1. Les cellules souches pluripotentes humaines SCTi003-A peuvent se différencier efficacement en cellules progénitrices neurales (CPN)

L’expression a été quantifiée pour (A) PAX6, (B) SOX1 et (C) la β-tubuline de classe III (TUJ1). (D) Les CPN présentent la morphologie attendue, à savoir de petite taille et en forme de goutte d’eau.

(E) L’expression des marqueurs a été quantifiée pour les marqueurs de CPN et les marqueurs de cellules neurales matures. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (n = 2 réplicats biologiques).

iPSCdirect🅪 : Accélérez vos expériences sur les CSP

Évitez les problèmes associés au maintien à long terme d’une culture de CSPi et augmentez l’efficacité et la productivité de vos recherches sur les cellules souches en vous servant de la lignée iPSCdirect🅪, une source à haute densité et à usage unique de CSPi singularisées immédiatement prêtes à l’emploi dès leur décongélation (figure 2). Gagnez du temps et réduisez le taux de variabilité de vos recherches en amorçant chaque expérience avec la même source de CSPi ayant fait l’objet d’une caractérisation exhaustive. Hautement homogène et robuste, iPSCdirect🅪 vous fera épargner les coûts et les efforts associés au développement et à la caractérisation des banques cellulaires maîtresses et de travail. Dérivée de la lignée contrôle de CSPi humaines saines SCTi003-A, iPSCdirect🅪 a fait l’objet de procédures rigoureuses de contrôle de la qualité et offre des niveaux élevés d’homogénéité et de performance. La lignée IPSCdirect🅪 a été optimisée pour être compatible avec mTeSR🅪 Plus et CloneR🅪2 pour l’ensemencement et avec STEMdiff🅪 pour la différenciation (figure 2).

Figure 2. Schéma d’un protocole monocouche généralisé pour la décongélation et la culture des cellules iPSCdirect🅪 pour les tests en aval

Lors de leur utilisation, les cellules iPSCdirect🅪 sont décongelées et placées dans le milieu mTeSR🅪 Plus, supplémenté de CloneR🅪2. Elles sont ensuite incubées pendant une nuit selon les directives du produit. Après 24 heures, les cellules sont prêtes à être placées dans le milieu STEMdiff🅪 ou à être intégrées à un flux de travail monocouche adapté.

iPSCdirect🅪 est un produit vendu exclusivement à des fins de recherche et est homologué pour une utilisation universitaire ou commerciale. Les cellules sont également stables sur le plan du caryotype, offrent un potentiel de différenciation trilignée et expriment des marqueurs de cellules indifférenciées. Source immédiate de CSPi humaines, iPSCdirect🅪 convient à de nombreuses applications dans le domaine de la recherche sur les cellules souches, notamment la recherche fondamentale visant à étudier les mécanismes d’autorenouvellement, de différenciation et de maintenance des cellules souches. Après décongélation et incubation pendant une nuit, iPSCdirect🅪 est prêt pour une différenciation en cellules spécialisées, telles que des cardiomyocytes ventriculaires, des cellules apparentées à des hépatocytes et des cellules progénitrices neurales dans les 24 heures suivant l’ensemencement (figure 4). En vous épargnant les tâches accaparantes associées à la maintenance des CSPi, iPSCdirect🅪 accroîtra la capacité de découverte de votre laboratoire en augmentant le potentiel de criblage des médicaments candidats sur le plan de l’innocuité et de l’efficacité, d’identification des composés les plus intéressants et d’optimisation des stratégies de dosage et d’administration des médicaments des CSPi humaines.

Figure 3. La lignée iPSCdirect🅪 peut être atteindre divers degrés de confluence 24 heures après l’ensemencement

Pour obtenir le degré de confluence souhaité pour les expériences en aval, décongelez les cellules iPSCdirect🅪 et plaquez-les dans mTeSR🅪 Plus supplémenté de CloneR🅪2. Ces exemples représentatifs de faible confluence (A), de confluence moyenne (B) et de confluence élevée (C) ont été cultivés après décongélation sur la matrice qualifiée CSEh Corning® Matrigel® et sont agrandis par un facteur de 4 X.

Figure 4. Les cellules souches pluripotentes humaines iPSCdirect🅪 dérivées de la lignée SCTi003-A peuvent se différencier en hépatocytes

Les cellules iPSCdirect🅪 dérivées de la lignée SCTi003-A ont été plaquées conformément à la fiche d’information du produit iPSCdirect🅪 en préparation du jour 1 du protocole STEMdiff🅪 Hepatocyte Kit (no de catalogue 100-0520) décrit dans la fiche d’information du produit STEMdiff🅪 Hepatocyte Kit. (A) Des monocouches de cellules apparentées à des hépatocytes présentant une morphologie polygonale et une binucléation caractéristiques sont apparentes au 21e jour de différenciation. (B) L’expression des marqueurs a été quantifiée par cytométrie en flux pour les marqueurs hépatiques de : albumine (ALB) et alpha1-antitrypsine (A1AT). Les barres d’erreur représentent l’écart-type (n = 3 réplicats biologiques).

Le tableau 2 présente une comparaison entre le produit SCTi003-A provenant du dépôt de CSPi de STEMCELL et le produit iPSCdirect🅪 En résumé, SCTi003-A est conçu pour la maintenance à long terme et la génération de banques cellulaires, tandis qu’iPSCdirect🅪 est à usage unique seulement, mais possède les mêmes propriétés de donneur et de lignée cellulaire. Les tests en aval, par exemple de différenciation, peuvent être entrepris à partir de iPSCdirect🅪 24 heures après la décongélation (figure 4). Que vous ayez besoin de CSPi de haute qualité pour une maintenance à long terme ou pour lancer rapidement vos applications en aval, STEMCELL Technologies a ce qu’il vous faut.

Tableau 2. Comparaison entre SCTi003-A et iPSCdirect🅪

*iPSCdirect🅪 est disponible en format de 10 unités pour une utilisation en tant que banque cellulaire maîtresse. Bien que les deux produits commerciaux soient dérivés du même tissu de donneur et de la même lignée cellulaire, iPSCdirect🅪 et SCTi003-A présentent un certain nombre de différences essentielles, notamment en ce qui concerne la forme, les droits de licence et les restrictions d’utilisation.

Pour plus d’informations sur les lignées de CSPi de STEMCELL, consultez notre Foire aux questions sur les CSPi. Pour tout autre renseignement, vous pouvez cliquer ici pour communiquer avec l’équipe des CSPi de STEMCELL ou nous envoyer un courriel à l’adresse iPSCrequests@stemcell.com.

Références

Guhr A et al. (2018) Recent Trends in Research with Human Pluripotent Stem Cells: Impact of Research and Use of Cell Lines in Experimental Research and Clinical Trials. Stem cell reports 11(2): 485–96
Felkner D et al. (2019) “Human pluripotent stem cell quality: A scientific wake‐up call.” Poster presented at the ISSCR Annual Meeting, Los Angeles, California
Drexler HG et al. (2002) Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology 39(2): 75-90
Uphoff C et al. (2005). Detection of Mycoplasma Contaminations. Humana Press 290
Merkle F et al. (2017) Human pluripotent stem cells recurrently acquire and expand dominant negative P53 mutations. Nature 545, 229–233
Rouhani FJ et al. (2022) Substantial somatic genomic variation and selection for BCOR mutations in human induced pluripotent stem cells. Nat Genet 54, 1406–1416
The International Stem Cell Banking Initiative. (2009) Consensus Guidance for Banking and Supply of Human Embryonic Stem Cell Lines for Research Purposes. Stem Cell Rev and Rep 5, 301–314
Sullivan S et al. (2018) Quality control guidelines for clinical-grade human induced pluripotent stem cell lines Regenerative Medicine 13(7): 859-866

À PROPOS DE STEMCELL TECHNOLOGIES

STEMCELL Technologies fournit des milieux de culture cellulaire de haute qualité, des technologies de séparation cellulaire, des instruments, des produits accessoires et des ressources éducatives aux scientifiques du monde entier qui œuvrent dans les domaines des cellules souches, de l’immunologie, du cancer, de la médecine régénératrice et de la recherche sur les thérapies cellulaires. STEMCELL a comme mission d’améliorer la vie des gens à l’aide du savoir de pointe et de découvertes scientifiques, par notre engagement de promouvoir la diversité et l’inclusion dans les secteurs des STIM et des sciences de la vie, et grâce aux investissements que nous faisons pour soutenir le développement durable, la communauté et la responsabilité sociale. Notre entreprise de scientifiques au service des scientifiques est ancrée dans l’expertise et la rigueur scientifiques et a à cœur d’améliorer le monde dans lequel nous vivons.

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